循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (CTC) 與循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞 (CTEC)
實(shí)體腫瘤中的某些腫瘤細(xì)胞 (Tumor Cell, TC) 可侵潤血管 (主動(dòng)性內(nèi)滲)，脫落并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)形成循環(huán)腫瘤細(xì)胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)。其中，某些 CTC 可由血液帶至某一特定器官處后，粘附、侵潤并穿出血管 (主動(dòng)性外滲)，最終形成新的腫瘤轉(zhuǎn)移灶。腫瘤復(fù)發(fā)與腫瘤轉(zhuǎn)移有著類似的過程。腫瘤組織富含大量血管。與正常組織血管壁上的內(nèi)皮細(xì)胞不同，腫瘤組織血管壁上的內(nèi)皮細(xì)胞被稱為“腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞”(Tumor-derived Endothelial Cell, TEC) (Hida and Klagsbrun, 2005 Cancer Res 65:2507)。這些細(xì)胞脫落入血后形成“循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞”(Circulating TEC, CTEC) (Lin et al., 2017 Sci Rep 7:9789)。TC/CTC 及 TEC/CTEC 均具有腫瘤的典型標(biāo)志 - 染色體異倍體。CTC 與 CTEC 共同構(gòu)成了一對(duì)“細(xì)胞型循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物”，在腫瘤血管生成及腫瘤發(fā)生、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等過程中相互協(xié)調(diào)，發(fā)揮著極為重要的作用。目前已證明，CD31- 腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)低氧的腫瘤微環(huán)境中或腫瘤細(xì)胞體外低氧培養(yǎng)條件下，可轉(zhuǎn)分化 (transdifferentiation) 成為 CD31+ 腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞 (Lin, 2020 Cells 9:1539)。
應(yīng)用賽特 SE-i?FISH? 檢測(cè) CTC 及 CTEC
賽特生物與美國 Cytelligen 公司密切合作，在世界上首次成功將差相富集 (SE) 與免疫熒光染色-染色體熒光原位雜交 (i·FISH) 整合為獨(dú)特的 SE-i·FISH 技術(shù)平臺(tái)。該技術(shù)擁有國內(nèi)外 CTC 分離、鑒別的兩項(xiàng)國家發(fā)明專利 (ZL 2009 1 0137289.0，ZL 2011 1 0340544.9) ，可有效檢測(cè)腫瘤患者或腫瘤動(dòng)物模型中的 CTC、循環(huán)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞 CTEC 及其各種亞類細(xì)胞。SE-i·FISH 已被成功應(yīng)用于以下多種 CTC 及 CTEC 的相關(guān)臨床檢測(cè)。CTC 最近也已被納入美國 NCCN 及 AJCC 腫瘤分期指南。
迄今為止，賽特生物團(tuán)隊(duì)已與上百家國內(nèi)外知名醫(yī)院、科研院所（如美國 UCLA、UCSD、Scripps、德國慕尼黑大學(xué)醫(yī)學(xué)中心、北京協(xié)和醫(yī)院、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院/中國國家癌癥中心、北京大學(xué)腫瘤中心、上海華山醫(yī)院、四川大學(xué)華西醫(yī)院等）及多家制藥公司密切合作，對(duì)近4萬例涵蓋各種實(shí)體腫瘤的大樣本上進(jìn)行臨床驗(yàn)證，在 CTC 的臨床應(yīng)用（如腫瘤早診、療效快速評(píng)估、耐藥與復(fù)發(fā)的實(shí)時(shí)性監(jiān)測(cè)等）及 CTC 單細(xì)胞研究等領(lǐng)域取得了豐碩成果，在《Clinical Cancer Research》、《Science Advances》等多個(gè)國際著名雜志上發(fā)表了多篇 SCI 高分論文。國際頂級(jí)期刊“科學(xué)”雜志已將獨(dú)特的賽特 SE-i·FISH 作為最具有代表性的 CTC 檢測(cè)技術(shù)向全球讀者進(jìn)行了報(bào)道 (Science 2013, 341:415) 。由國家科技部、衛(wèi)計(jì)委共同組建的腫瘤轉(zhuǎn)化醫(yī)療平臺(tái)，也將賽特生物的 SE-i·FISH 作為 CTC 的主要檢測(cè)技術(shù)向國內(nèi)外廣大腫瘤界同行進(jìn)行了推薦 (http://101.200.216.160:888/yyfw/285.jhtml) 。
差相富集技術(shù) (Subtraction Enrichment, SE)
差相富集技術(shù)的主要作用原理是應(yīng)用與白細(xì)胞相結(jié)合的免疫磁珠及特殊密度的非血源性細(xì)胞分離介質(zhì)快速、高效地去除血液中絕大多數(shù)的白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血漿蛋白，從而達(dá)到從人或腫瘤動(dòng)物模型體液中有效富集非血源性腫瘤細(xì)胞的目的。
賽特免疫磁珠的高特異性：
由特殊工藝制備的 Cytelligen 賽特免疫磁珠偶聯(lián)了多種抗白細(xì)胞抗體以確保對(duì)白細(xì)胞的最佳去除效果。該免疫磁珠上的抗體僅與血源性白細(xì)胞相結(jié)合，而與非血源性腫瘤細(xì)胞無交叉反應(yīng)。磁珠表面的特殊包被工藝確保了免疫磁珠與各種細(xì)胞不發(fā)生非特異性粘附。
因富集過程不依賴腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)示物的表達(dá)，故可通用于所有不同實(shí)體腫瘤來源的 CTC 富集。富集過程中由于避免使用抗體直接抓取細(xì)胞及避免使用低滲溶破法去除紅細(xì)胞，所以富集后的腫瘤細(xì)胞維持了很好的自然狀態(tài)及很高的生物活性，適于后續(xù)原代腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)及一系列各種形態(tài)學(xué)與功能性的相關(guān)研究。此外，SE 也可以有效富集分離各種大小不同的 CTC 、細(xì)胞團(tuán)（癌栓，circulating tumor microemboli, CTM）。差相富集技術(shù)從技術(shù)層面解決了以往常見的 CTC 捕獲效率及捕獲豐度較低的問題，具有“非依賴、全亞型、高捕獲率、高活性”等特點(diǎn)。
各種 CTC 分離方法比較
SE-i?FISH? 技術(shù)有效區(qū)分、鑒別“細(xì)胞型循環(huán)腫瘤標(biāo)志物”CTC 與 CTEC
為了確保高靈敏、高特異性地有效檢測(cè)、分型各種 CTC 及 CTEC，賽特生物將細(xì)胞內(nèi)生物鏈三要素（核酸、蛋白及細(xì)胞形態(tài)）整體考量，開發(fā)出了 i·FISH 整合技術(shù)平臺(tái)，以同步、原位檢測(cè)細(xì)胞上的染色體核型、腫瘤標(biāo)志物蛋白表型及細(xì)胞形態(tài)。 i·FISH 鑒別技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)富集的 CTC 進(jìn)行核酸水平和蛋白水平的同步、原位雙重鑒定，將免疫熒光染色與染色體熒光原位雜交 (FISH) 進(jìn)行了有效整合，使得 CTC 計(jì)數(shù)、核型分析、表型分析、分子分型一步到位。
依據(jù)特定瘤標(biāo)表達(dá)的有無、強(qiáng)弱及染色體的異常倍體特性，可以鑒別出具有不同臨床意義（如耐藥、腫瘤轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)等）的各種 CTC 及 CTEC 亞類細(xì)胞。從而為進(jìn)一步探索 CTC、CTEC 及其亞類與腫瘤的預(yù)后、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等的相關(guān)性研究提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)與可靠的依據(jù)。大量臨床實(shí)驗(yàn)證明，相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查或目前常規(guī)的 CK 染色判斷 CTC，i·FISH 具有其它方法無可比擬的一系列特殊優(yōu)勢(shì)。
SE-i?FISH? 的獨(dú)特技術(shù)優(yōu)勢(shì)
| （1） | 方法簡便、快捷、高效，適用于檢測(cè)各種生物體液樣本，如血液、胸水、腹水、骨髓、尿液、腦脊液、淋巴穿刺、宮頸涂片等 |
| （2） | 不依賴于腫瘤細(xì)胞表面標(biāo)示物的表達(dá)，可同步檢測(cè)所有實(shí)體上皮腫瘤各種 CTC、CTEC 及相應(yīng)細(xì)胞團(tuán) |
| （3） | 根據(jù)染色體不同倍體數(shù)目、腫瘤標(biāo)志物蛋白表達(dá)及細(xì)胞大小，可對(duì) CTC 及 CTEC 進(jìn)行亞類分型，從而鎖定具有不同臨床意義（如腫瘤進(jìn)展、轉(zhuǎn)移、耐藥、復(fù)發(fā)等）的不同亞類細(xì)胞 |
| （4） | 富集的細(xì)胞維持了極高生物活性，適于后續(xù)原代細(xì)胞培養(yǎng) |
| （5） | i·FISH 鑒別出的 CTC 及 CTEC 亞類細(xì)胞適于后續(xù)單細(xì)胞測(cè)序 |
SE-i?FISH? (NC) 有效區(qū)分及全方位聯(lián)合檢測(cè)活性與壞死細(xì)胞 CTC、CTEC (necrotic cell, NC)
（1）在SE-iFISH 基礎(chǔ)上有效富集、鑒別及聯(lián)合檢測(cè)各種活性與壞死異倍體 CTC、CTEC 亞類細(xì)胞
（2）可用于基礎(chǔ)、轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究及臨床快速評(píng)估療效、動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥及進(jìn)展
（3）有效檢測(cè)患者接受全程治療后殘存的與腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)密切相關(guān)的腫瘤微小殘留病灶 (MRD) CTC 、CTEC 活細(xì)胞
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